В настоящее время существует множество методов неклинических исследований in vitro и in vivo, а также опыт разработки лекарственных препаратов. Однако прогнозирование клинической эффективности и безопасности с помощью оптимизированных до-клинических исследований остается сложной задачей, и в этой статье проводится-углубленный анализ этого вопроса.
Идеальные АЦП должны обладать как минимум следующими тремя характеристиками:
1. Способность таргетного связывания: идеальный целевой антиген ADC экспрессируется только на поверхности опухолей и на высоких уровнях, без легкого выделения.
2. Процесс трансформации. Прежде чем достичь клеток-мишеней, цитотоксическая молекула в идеале не должна отделяться от ADC, то есть весь ADC интернализуется в клетки.
3. Высвобождение небольшой молекулы токсина. Небольшая молекула должна быстро и массово высвобождаться внутри опухолевых клеток; небольшая молекула должна обладать высокой токсичностью, чтобы эффективно убивать опухолевые клетки.
Стратегия фармакологической оценки ADC
Исследования фармакологического действия обычно проводятся на этапе открытия лекарственного средства или доклинической оценки. Основные экспериментальные проекты, которые необходимо реализовать, включают активность связывания мишени, интернализацию, опосредованную антителами-, ингибирование пролиферации опухоли in vivo и in vitro (для противо-опухолевых ADC), антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC).
При изучении фармакодинамики ADC у животных в первую очередь следует учитывать видовые различия. Если ADC не обладают активностью связывания или имеют низкую активность связывания с антигенами у мышей, необходимо рассмотреть возможность использования трансгенных животных для фармакодинамических экспериментов или проведения фармакодинамических исследований in vivo с антителами, полученными из -животных. Трансгенные животные могут избежать использования альтернативных антител, а когда целевой антиген экспрессируется в кровеносных сосудах или строме хозяина, трансгенные животные могут не только оценивать фармакодинамические эффекты, но и в некоторой степени наблюдать реакции токсичности. Если целевой антиген экспрессируется только в опухолевых клетках человека, нет необходимости в трансгенных животных; фармакодинамические эффекты можно исследовать на моделях голых мышей, которым имплантированы опухолевые клетки человека. При проведении фармакодинамических исследований на клеточном уровне или уровне животных моделей одновременное проведение исследований ФК/ФД, анализ распределения таргетного действия препарата, степени занятости рецепторов и взаимосвязи между воздействием препарата и эффектом может помочь в разработке клинических режимов дозирования и анализе результатов исследований безопасности.
Стратегия токсикологической оценки для ADC
Выбор вида животных. Для полного раскрытия характеристик токсичности ADC в не-клинических исследованиях безопасности для поддержки клинической разработки ADC решающее значение имеет оценка актуальности тестируемых видов животных и переводимости результатов до-клинических исследований. Это определение обычно включает проверку аффинности связывания ADC с целевыми антигенами у не-клинических видов по сравнению с людьми, а также сравнение спектра иммуногистохимического окрашивания в исследованиях перекрестной-реактивности тканей. Эффекторные функции или иммуногенность антител также могут различаться из-за видовых различий.
Параметры воздействия и метаболизм. Кроме того, как и в случае с другими лекарственными средствами и биологическими продуктами, экстраполяция результатов до-неклинических исследований на человека должна включать сравнение параметров воздействия и метаболизма. Например, BR-96 представляет собой ADC, образованный путем ковалентного связывания доксорубицина (DOX) с остатками цистеина гуманизированного моноклонального антитела BR96 через линкер из гидразида 6-малеимидогексановой кислоты. Токсикологические исследования показали, что, в отличие от крыс и обезьян, собаки более чувствительны к токсическому воздействию BR-96, при этом геморрагический энтерит является дозолимитирующей токсичностью. Неожиданно BR96-DOX и немодифицированное моноклональное антитело BR96 обладают одинаковой дозолимитирующей токсичностью, что указывает на то, что токсичность вызывается моноклональным антителом. В отличие от немодифицированного DOX, ADC не вызывали кардиомиопатию на моделях крыс. Таким образом, выбор дозы для фазы I клинического исследования BR96-Dox на людях был основан на результатах токсикологии на собаках.
Экспрессия мишени антител. Как и в случае с терапевтическими моноклональными антителами, не-клиническая оценка ADC может быть затруднена из-за отсутствия мишеней антигена у подопытных животных. В рекомендациях ICH S6 (R1) по доклинической оценке безопасности биотехнологических-фармацевтических препаратов (2011 г.) говорится: «Выбор видов для конъюгатов антитело-лекарство/токсин (ADC), содержащих новые токсины/токсины, должен следовать тем же общим принципам, что и для немодифицированных антител. Соответствующими видами животных для тестирования моноклональных антител являются те, которые экспрессируют необходимый эпитоп и демонстрируют тканевую структуру. перекрестный-спектр реактивности аналогичен спектру человеческих тканей. Таким образом, видовая специфичность и болезнь могут определять или ограничивать не-клиническую оценку".
Нормальная тканевая экспрессия целевого антигена является серьезной проблемой безопасности терапии ADC. В идеале целевой антиген должен экспрессироваться на очень низких уровнях нормальных клеток; однако, как упоминалось в двух приведенных выше примерах, на практике антитела не всегда специфичны. Другие примеры потенциальной токсичности, связанные с отсутствием специфичности к мишеням ADC, включают NaPi2b, натрий-зависимый переносчик фосфатов, который экспрессируется в нескольких типах опухолей, но также обнаруживается в нормальных тканях, где он играет роль в гомеостазе неорганических фосфатов. ADC (анти-NaPi2b-vc-MMAE) был разработан путем конъюгации гуманизированного моноклонального антитела IgG1 анти-NaPi2b с MMAE через пептидный линкер vc, и было подтверждено, что он обладает специфической аффинностью связывания в нормальных тканях человека и крабовых мартышек. Однако, несмотря на высокий-уровень экспрессии в нормальных легких обезьян, безопасность этой перекрестной-реактивности может быть приемлемой, при этом доза-ограничивающая токсичность не связана с экспрессией в нормальных тканях. Токсикологические эффекты у нормальных крыс, не-несвязывающих видов и обезьян соответствуют фармакологии ММАЭ.
Общие принципы токсикологического проектирования. Как правило, нет необходимости устанавливать отдельные группы для моноклональных антител/голых антител, линкера/линкерного-токсина, поскольку молекула моноклонального антитела является одним из основных факторов, влияющих или определяющих системное воздействие. При выборе дозы следует учитывать фармакодинамику дозы АЦП, характеристики молекулы антитела и особенности токсичности низкомолекулярного токсина.
Сосредоточьтесь на токсичности, связанной с-полезной нагрузкой:Хотя целевое высвобождение низкомолекулярных соединений обеспечивает обогащение лекарственными средствами тканей-мишеней, улучшая терапевтическое окно, основные характеристики токсичности ADC по-прежнему аналогичны характеристикам связанных низкомолекулярных соединений. Большинство реакций токсичности ADC менее серьезны, чем прямое введение низкомолекулярных соединений, но некоторые ADC могут усиливать реакции тканевой токсичности, связанные с связыванием антитела с мишенью или не-связыванием с мишенью. Хотя ADC увеличивают целевое высвобождение низкомолекулярных соединений, некоторые низкомолекулярные соединения все же высвобождаются преждевременно, а некоторые свободные низкомолекулярные соединения могут быстро диффундировать или переноситься в окружающие ткани и системный кровоток из клеток-мишеней, или апоптоз и повреждение клеток-мишеней могут привести к попаданию свободных низкомолекулярных соединений в системный кровоток. Антительная часть ADC может также связываться с другими нецелевыми рецепторами или эпитопами поверхности клеток тканей и органов, такими как клеточный фагоцитоз, опосредованный рецептором Fc-, и препарат может оказывать токсическое воздействие на соответствующие клетки ткани после метаболического распада. Следовательно, токсичность ADC тесно связана с характеристиками антитела, низкомолекулярных соединений и линкеров, и изменения в характеристиках токсичности ADC будут происходить с изменением антител, низкомолекулярных соединений и линкеров. В не-клинических исследованиях безопасности следует уделять внимание влиянию структуры состава препарата и фармакокинетических характеристик на токсичность, а результаты экспериментов следует всесторонне анализировать.
Генотоксичность:Биологические макромолекулы обычно не взаимодействуют напрямую с ДНК, а ADC и его антителообразующая часть обычно не нуждаются в тестах на генотоксичность. Потенциальная генотоксичность ADC связана с низкомолекулярными соединениями. Если низкомолекулярное соединение полезной нагрузки является новым соединением, следует провести испытания на генотоксичность; для новых свободных низкомолекулярных соединений и/или новых линкеров, образующихся в организме, целевые тестируемые материалы следует оценивать на основе физико-химических свойств, характеристик расщепления и структуры продуктов расщепления ADC; если достаточные данные указывают на то, что целевой исследуемый материал обладает генотоксичностью, исследования генотоксичности не требуются.
Репродуктивная токсичность:Низкомолекулярные соединения, линкеры и голые антитела в ADC могут оказывать неблагоприятное воздействие на репродуктивные органы, фертильность, развитие эмбриона-плода и развитие потомства, поэтому следует обращать внимание на риск репродуктивной токсичности ADC. Стратегия исследования, дизайн эксперимента, реализация и оценка репродуктивной токсичности ADC должны соответствовать рекомендациям ICH S5 и сочетать механизм действия и целевую группу ADC для принятия стратегии анализа конкретной проблемы-специфической. ADC, предназначенные для пациентов с опухолями на поздней- стадии, можно использовать в рекомендациях ICH S9 по исследованиям репродуктивной токсичности.
Репродуктивная токсичность биологических продуктов обычно оценивается на фармакологически значимых видах животных. Если и грызуны, и кролики относятся к родственным видам животных, -связывающим мишень, для проведения тестов на токсичность для развития эмбриона-плода следует использовать два вида животных, если только у одного вида не подтверждена эмбриональная летальность или тератогенность. Если целевые виды животных, -связывающие которые не являются-приматами человека, или соответствующие виды животных отсутствуют, крыс или кроликов обычно рассматривают в первую очередь для проведения тестов на репродуктивную токсичность с целью изучения репродуктивной токсичности свободных низкомолекулярных соединений. Если результаты исследования подтвердят положительный результат, нет необходимости исследовать репродуктивную токсичность с использованием целевых -связывающих родственных видов животных; в противном случае следует рассмотреть возможность тестирования не-приматов, трансгенных животных или альтернативных молекул для выявления антиген-опосредованной репродуктивной токсичности. Если антитело или низкомолекулярное соединение в ADC имеют литературные данные, ясно показывающие потенциальные риски репродуктивной токсичности, исследования репродуктивной токсичности не нужны, и соответствующий контроль риска может быть основан на литературной информации.
Канцерогенность:Основываясь на характеристиках ADC, можно рассмотреть необходимость исследований канцерогенности в соответствии с ICH S1, ICH S6, ICH S9 и другими соответствующими рекомендациями.
Иммуногенность/Имунотоксичность:ADC могут вызывать иммуногенность после попадания в организм, вырабатывая антитела против-лекарственных препаратов. Оценка иммуногенности ADC помогает проанализировать фармакокинетику, эффективность и безопасность препарата, поэтому обнаружение антител к-лекарственному средству обычно сопровождается не-клиническими исследованиями безопасности ADC. Антитела против -лекарственных средств могут быть получены из части антитела и линкерной части ADC, и необходимость дальнейшего изучения эпитопов антигена должна определяться риском иммуногенности. Стратегия разработки, валидации и аналитического обнаружения для анализа иммуногенности ADC должна соответствовать «Техническим рекомендациям по исследованию иммуногенности лекарственных средств». ADC могут ссылаться на ICH S6, ICH S8, ICH S9 и другие рекомендации и разумно разрабатывать индикаторы обнаружения иммунотоксичности на основе таких факторов, как тип и механизм действия ADC. В дополнение к рутинным исследованиям иммунотоксичности при необходимости следует рассмотреть возможность проведения дополнительных исследований иммунотоксичности.
Оптическая безопасность:Перед клиническими испытаниями фазы I следует предварительно оценить потенциальную фототоксичность на основе фотохимических свойств и фармакологических/химических категорий низкомолекулярных соединений (включая линкеры). Если эти данные указывают на потенциальный риск, следует принять соответствующие меры защиты для участников клинических исследований. Если не-клинические данные или клинический опыт не могут полностью оценить риск фотобезопасности, перед крупными-выборочными клиническими исследованиями (Фаза III) следует провести оценку безопасности фотосъемки в соответствии с принципами, описанными в ICH S10.
Перекрестная-реактивность тканей:Исследования перекрестной-реактивности тканей – это тесты на связывание тканей in vitro, проводимые с использованием иммуногистохимических методов для определения характеристик связывания антител и эпитопов антигенов в тканях. Исследования перекрестной-реактивности тканей могут предоставить полезную дополнительную информацию для понимания целевого распределения, а также информацию о потенциальном неожиданном связывании. Исследования тканевой перекрестной-реактивности с использованием тканей человека являются неотъемлемой частью первоначальной серии клинических оценок безопасности дозирования препаратов на основе антител. При отсутствии родственных видов животных, -связывающих мишени, информация о перекрестной-реактивности тканей особенно важна для прогнозирования рисков токсичности для человека. Для ADC, предназначенных для лечения опухолей на поздней- стадии, исследования тканевой перекрестной-реактивности не требуются, если нет особых проблем после оценки токсикологического воздействия на соответствующие виды животных.
В настоящее время ICH, FDA, NMPA и другие агентства выпустили соответствующие технические руководства для не-клинических фармакологических и токсикологических исследований ADC. Исследователи могут проводить научно обоснованные не-клинические фармакологические и токсикологические исследования на основе характеристик препаратов, максимально экстраполируя фармакодинамические эффекты и реакции токсичности не-на уровне животных-на человека, прогнозируя эффективность и безопасность ADC в клинических применениях, тем самым повышая вероятность успеха клинических испытаний и снижая риски разработки. Разработчики лекарств могут связываться с регулирующими органами на основе предварительных результатов исследований и существующих проблем, чтобы получить научно стандартизированную информацию для поддержки не-клинических исследований.
