Почему хорошие данные in vitro могут оказаться неэффективными in vivo: переосмысление DMPK применительно к различным лекарственным препаратам

«Данные in vitro выглядят превосходно».

Это утверждение часто встречается при открытии лекарств. Кандидат демонстрирует сильную биохимическую эффективность, благоприятную клеточную активность, хорошую селективность, высокую метаболическую стабильность и ограниченное ингибирование CYP. На бумаге молекула выглядит готовой к использованию в фармакологии и фармакокинетических исследованиях на животных.

Почему же тогда кандидат с убедительными данными in vitro может по-прежнему плохо работать in vivo?

Небольшая молекула может демонстрировать превосходную микросомальную стабильность, но неожиданно высокий клиренс у животных. Антитело может демонстрировать сильное связывание с мишенью и эффективность в отношении клеток, но не обеспечивает достаточного охвата мишени in vivo. ADC может сохранять благоприятное воздействие антител, но преждевременно высвобождает свою полезную нагрузку. Пептид может выглядеть стабильным in vitro, но быстро выводиться in vivo. Концентрации нуклеиновых кислот в плазме могут быстро снижаться, даже если фармакологическая активность сохраняется в течение недель или месяцев.

Эти результаты не являются противоречиями. Они отражают основной принцип ДМПК: анализы in vitro изолируют отдельные механизмы, тогда как фармакокинетика in vivo отражает поведение всей биологической системы. Соответствующий вопрос заключается не в том, является ли лекарство «стабильным» или имеет «длительный период полураспада», а в том, обеспечивает ли его расположение достаточное воздействие в месте действия и в молекулярной форме, необходимое для фармакологической активности.

После введения лекарственное средство проходит через последовательность взаимосвязанных процессов: всасывание, распределение, метаболизм, выведение, проникновение в ткани, взаимодействие с мишенью и последующую фармакологию.

Анализ in vitro исследует только один компонент этой системы. Например, микросомальная стабильность описывает внутренний метаболический обмен в определенных экспериментальных условиях. Сам по себе он не определяет почечный клиренс, выведение, опосредованное транспортером, распределение в тканях, связывание с белками плазмы или вклад внепеченочного метаболизма.

То же самое относится и к более сложным модальностям. Системное воздействие антител зависит не только от рециркуляции, опосредованной FcRn-, но также от целевой экспрессии и диспозиции, опосредованной мишенью-. Для ADC общее воздействие антител не обязательно представляет собой воздействие интактных, фармакологически компетентных ADC. Для пептидов и нуклеиновых кислот распределение в тканях и внутриклеточная персистенция могут иметь большее значение, чем стабильность плазмы.

Поэтому интерпретация DMPK должна перейти от изолированных параметров к структуре воздействия,-основанной на механизме:

Молекулярные свойства → абсорбция и распределение → воздействие на ткани → взаимодействие с мишенью → фармакодинамический ответ

Неудача на любой стадии нарушает взаимосвязь между эффективностью in vitro и эффективностью in vivo.

Для обычных малых молекулранние программы ДМПКобычно включают микросомальную стабильность печени, стабильность гепатоцитов, ингибирование или индукцию CYP, стабильность плазмы и оценку проницаемости.

Микросомальная стабильность полезна, поскольку она характеризует восприимчивость соединения к окислительному метаболизму в печени. Однако высокую микросомальную стабильность не следует рассматривать как низкий системный клиренс.

Клиренс in vivo может также включать почечную фильтрацию и секрецию, экскрецию с желчью, активность транспортера, внепеченочный метаболизм и другие механизмы выведения. Распределение может дополнительно изменить наблюдаемый временной профиль концентрации в плазме-.

Half-life также требует внимательного прочтения. Потому что:

t₁/₂=0.693 × Vd / CL

длительный конечный период полувыведения-может быть следствием низкого клиренса, большого кажущегося объема распределения или того и другого. Короткий период полу-в свою очередь, не означает только быструю метаболическую деградацию.

Это различие имеет значение при экстраполяции между видами. Ферменты и переносчики,-метаболизирующие лекарственные средства, различаются у грызунов, собак, приматов, не являющихся-человеком, и людей. Фармакокинетика животных не всегда может быть предсказана на основе одного метаболического анализа in vitro или у другого вида без объединения нескольких линий доказательств.

Таким образом, малая-молекула ДМПК должна ответить на два отдельных вопроса:

Насколько стабильно соединение?

И какие механизмы доминируют в его выведении и воздействии in vivo?

Вопросы взаимосвязаны, но не взаимозаменяемы.

Терапия больших-молекул действует в рамках другой структуры DMPK.

Для обычных антител IgG рециркуляция, опосредованная FcRn-, существенно способствует длительной системной персистенции. Однако сам по себе системный период полураспада не определяет, производит ли антитело адекватную фармакологическую активность.

Целевая экспрессия, распределение в тканях, рецепторная-интернализация и целевое-распределение лекарственного средства (TMDD) — все это может влиять на воздействие антител. Это особенно важно для антител, направленных против высокоэкспрессируемых или быстро интернализующихся мишеней, где связывание с мишенью становится частью пути элиминации и приводит к нелинейной или дозозависимой фармакокинетике.

Поэтому при разработке антител следует отказаться от вопроса о том, как долго антитело остается в плазме, и задаться вопросом, обеспечивает ли воздействие достаточное целевое покрытие в течение требуемого периода времени. Это различие играет центральную роль в интерпретации ФК/ФД: антитело может иметь благоприятный системный период полу-периода полураспада, но при этом быть неэффективным с фармакологической точки зрения, если проникновение в ткани или взаимодействие с мишенью недостаточны.

Конъюгаты антитела-лекарства добавляют еще один уровень сложности, поскольку терапевтическим объектом является не только антитело.

ADC содержит как минимум три функционально важных компонента: антитело, линкер и полезную нагрузку. После введения их поведение может отличаться.

Циркулирующие виды могут включать интактные ADC, частично деконъюгированные антитела, свободную полезную нагрузку и активные или неактивные катаболиты. Общая концентрация антител может оставаться относительно высокой даже при снижении концентрации фармакологически компетентных ADC.

Это создает важное аналитическое различие:

Общее воздействие антител ≠ воздействие интактного ADC ≠ воздействие активной полезной нагрузки

исследования АЦПпоэтому необходимо измерять такие параметры, как интактные или конъюгированные антитела, соотношение лекарственного средства-к-антителам (DAR), свободная полезная нагрузка, метаболиты, связанные с полезной нагрузкой-, и, если применимо, воздействие на ткани.

DAR также показывает, почему оптимизация одного параметра может ввести в заблуждение. Увеличение полезной нагрузки увеличивает содержание лекарственного средства на антитело, но чрезмерный DAR меняет физико-химические свойства, включая гидрофобность, склонность к агрегации, распределение в тканях и клиренс.

Главный вопрос DMPK для ADC заключается в том, может ли интактный ADC достичь соответствующей ткани, оставаться достаточно стабильным в кровообращении и высвобождать активную полезную нагрузку в нужном месте и в нужное время.

Пептидная терапия представляет собой еще одну особую проблему DMPK.

Многие эндогенные пептиды быстро расщепляются протеазами, а из-за небольшого молекулярного размера они также подвергаются значительному почечному клиренсу. Расширение воздействия пептидов часто требует изменения общего профиля диспозиции, а не только повышения устойчивости к ферментативному расщеплению.

Семаглутид является полезным примером. Его длительное системное воздействие связано со структурной модификацией, которая способствует связыванию альбумина, что снижает его выведение почками и увеличивает время кровообращения.

Более общий урок заключается в том, что пептид DMPK должен учитывать несколько взаимосвязанных свойств: протеолитическую стабильность, связывание с белками, почечный клиренс, распределение в тканях и взаимодействие с рецепторами. Пептид, который очень стабилен в анализе с изолированной протеазой, все же может иметь неблагоприятный профиль in vivo, если его доминирующий механизм клиренса находится в другом месте.

Малые интерферирующие РНК (миРНК) и антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) демонстрируют наиболее явное ограничение традиционной интерпретации ФК плазмы.

Для многих традиционных малых молекул концентрация в плазме разумно связана с воздействием в месте фармакологического воздействия. Для терапии нуклеиновыми кислотами эта связь может быть гораздо слабее.

После введения олигонуклеотид может распределяться в тканях, подвергаться клеточному поглощению и внутриклеточному транспорту, а также накапливаться в фармакологически значимых компартментах. Биологически значимое воздействие может сохраняться после снижения концентрации в плазме.

Инклисиран иллюстрирует это. В качестве миРНК, конъюгированной с GalNAc-, ее активность зависит от доставки в гепатоциты, участия механизма внутриклеточной РНК-интерференции и устойчивого подавления экспрессии PCSK9. Продолжительность фармакодинамической активности нельзя определить по временному графику концентрации в плазме-.

Тот же принцип еще более ясен для ASO,-направленных на ЦНС, таких как нузинерсен, где воздействие на спинномозговую жидкость и нервные ткани имеет большее значение для фармакологической активности, чем концентрация в плазме.

Для терапии нуклеиновыми кислотами соответствующая цепь:

Доза → распределение в тканях → клеточное поглощение → внутриклеточная персистенция → модуляция целевой РНК → продолжительность ПД.

Это фундаментально отличается от оценки обычной небольшой молекулы, главным образом, с помощью ФК плазмы.

Различия между модальностями можно резюмировать, задав вопрос о том, какое на самом деле наиболее значимое фармакологическое воздействие.

Таблица раскрывает более широкий смысл: конечные точки DMPK следует выбирать в соответствии с биологией терапевтического метода, а не применять единообразно для всех классов препаратов.

При рассмотрении пакета DMPK команды часто в первую очередь обращают внимание на AUC, Cmax, клиренс и период полу-периода полураспада. Эти параметры имеют значение, но сами по себе они не объясняют, подействует ли препарат.

Более полезная оценка начинается с четырех вопросов.

Где должен действовать препарат? Соответствующим компартментом может быть плазма, опухолевая ткань, печень, ЦНС или внутриклеточный компартмент.

Какая молекулярная форма является фармакологически активной? Для АЦП это может быть неповрежденная сопряженная или освобожденная полезная нагрузка. Для терапевтического препарата нуклеиновой кислоты общая концентрация может не отражать продуктивное внутриклеточное воздействие.

Может ли ПК объяснить БП? Если системное воздействие возрастает без соответствующего фармакодинамического ответа, проблема может заключаться в распределении в тканях, вовлечении мишени, внутриклеточной доставке или последующих биологических процессах, а не в самом системном воздействии.

Воспроизводит ли выбранная модель животного соответствующий механизм диспозиции? Видовые различия в ферментах, транспортерах, целевой экспрессии, биологии FcRn, распределении в тканях и болезненном состоянии могут влиять на трансляционную интерпретацию.

Эти вопросы сдвигают DMPK от набора числовых параметров к механистическому пониманию поведения наркотиков.

Целью DMPK не является максимизация какого-то одного параметра. Целью является установление последовательной взаимосвязи между дозой, воздействием, распределением, попаданием в цель, фармакодинамикой и, в конечном итоге, эффективностью и безопасностью.

Это имеет большее значение, поскольку развитие выходит за рамки обычных малых молекул и переходит к антителам, ADC, пептидам, олигонуклеотидам, клеточной и генной терапии и другим сложным методам.

Для некоторых программ ФК плазмы остается доминирующей конечной точкой трансляции. Для других более информативными доказательствами являются воздействие на ткани, целевое покрытие, концентрация интактного лекарства, внутриклеточная персистенция или распределение на основе визуализации-.Доклиническая визуализациямогут дополнять традиционные ФК, предоставляя продольную информацию о биораспределении, взаимодействии с мишенями и фармакодинамических изменениях у живых субъектов.

В исследованиях на приматах, не относящихся к человеку, интеграция ФК/ФД с измерениями уровня в тканях,-биомаркерами, визуализацией и фармакологическими конечными точками помогает установить, ведет ли кандидат поведение в соответствии с предполагаемым механизмом. Платформа переводческих исследований Prisys объединяетФармакология НХПс ФК/ФД, анализом биомаркеров, патологией и клиническими-эквивалентными изображениями, где это научно обосновано, что обеспечивает более комплексную интерпретацию распределения лекарств и фармакологии.

Урок прост: необходимы хорошие данные in vitro, но они не гарантируют хорошую фармакологию in vivo. Наиболее информативная стратегия DMPK следует за препаратом от молекулярного дизайна до фактического места его действия:

Молекулярные свойства → Расположение in vivo → Соответствующее воздействие на ткани → Поражение мишени → ПД → Эффективность и безопасность

Когда эта цепочка будет понята, неожиданные результаты in vivo перестанут быть «неудачными прогнозами» и станут механическими доказательствами, которые могут помочь в оптимизации кандидатов, планировании исследования и принятии решений-по результатам.

Свяжитесь с Prisys Biotech